顯微高光譜成像系統(tǒng)在臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)、微電子學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。很多用戶這種設(shè)備也比較好奇，本文簡單介紹了顯微高光譜成像系統(tǒng)的成像原理和結(jié)構(gòu)設(shè)計。

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顯微高光譜成像系統(tǒng)的成像原理

顯微高光譜成像實驗系統(tǒng)基于推帚式成像光譜儀的原理進行設(shè)計，光路原理圖如圖所示。

處于顯微鏡載物臺上的樣品被柯勒照明系統(tǒng)照明，瞬時視場內(nèi)的樣品條帶通過顯微鏡物鏡和0.6倍CMount接口鏡頭成像于分光計的狹縫處，再經(jīng)過光譜分光組件后，在垂直樣品條帶方向按光譜色散，最后成像于CCD像面。

CCD光敏面平行于狹縫的一維稱為空間維，垂直于狹縫的一維稱為光譜維，空間維每一行光敏元上得到的是樣品條帶一個光譜波段的像，這樣面陣CCD相機每幀圖像便對應(yīng)于一個樣品條帶的多光譜圖像。通過載物臺自動裝置對樣品進行推掃，就得到整個樣品的二維圖像及光譜數(shù)據(jù)，即圖像立方體。

整個系統(tǒng)由顯微鏡、分光計、面陣CCD相機、載物臺自動裝置以及數(shù)據(jù)采集與控制模塊等幾部分組成。系統(tǒng)的光譜范圍從400nm到800nm，120個波段，光譜分辨率優(yōu)于5nm，空間分辨率大約1μm。不僅能夠提供微小物體在可見光范圍的單波段顯微圖像，而且能夠獲得圖像中任一像素的光譜曲線，實現(xiàn)了光譜技術(shù)和顯微成像技術(shù)的結(jié)合，在微觀領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

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顯微高光譜成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)設(shè)計

1.?總體結(jié)構(gòu)設(shè)計

由于顯微鏡是帶有光源的主動光學(xué)系統(tǒng)，因此，為了獲得成像光譜，從總體上考慮，有兩種系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可供選擇：

一種是在前光學(xué)系統(tǒng)進行光譜分光，即采用波長調(diào)諧的照明光源，照明光源以一定的波長間隔連續(xù)或非連續(xù)地掃描，在每一個預(yù)定的波長處得到一個灰度圖像，波長掃描后便構(gòu)成光譜圖像立方體。這種方法的主要優(yōu)點是不用在成像光路中插入任何光學(xué)和機械元件，因而不會增加額外的光學(xué)像差。缺點是很費時，對于上百個波段的高光譜成像而言，往往需要長達小時量級的時間。而且，這種方法不適用于熒光應(yīng)用，因為要得到熒光需要激發(fā)光源。

另一種結(jié)構(gòu)是在后光學(xué)系統(tǒng)（即成像光束）中進行光譜分光，這是用于航空航天遙感領(lǐng)域的光譜成像儀中廣泛采用的方法，對于顯微高光譜成像系統(tǒng)，這種方案也可以借鑒。

因此，本顯微高光譜成像實驗系統(tǒng)采用后一種結(jié)構(gòu)形式，即在成像光束中進行光譜分光。利用推帚式光譜成像儀的原理進行設(shè)計，將光譜儀子系統(tǒng)光學(xué)耦合到生物顯微鏡的三目鏡筒上；利用高精度步進電機驅(qū)動載物臺進行微米級平動，實現(xiàn)推帚成像。

整個系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)上主要由顯微鏡、分光計、CCD相機、數(shù)據(jù)采集和控制系統(tǒng)幾部分組成。

2.?分光子系統(tǒng)設(shè)計

目前，用于成像光譜儀器的光譜分光方法主要有棱鏡分光、光柵分光、傅里葉變換、聲光可調(diào)諧濾光片、液晶可調(diào)諧濾光片、漸變?yōu)V光片、二元光學(xué)元件等方法。從目前的應(yīng)用情況來看，光柵分光仍是應(yīng)用廣泛而且技術(shù)相對成熟的光譜分光方法。因此，本系統(tǒng)仍采用傳統(tǒng)的光柵分光方法。而對于光柵而言，又可分為反射光柵和透射光柵。由于該系統(tǒng)屬于直視系統(tǒng)，即同軸光學(xué)系統(tǒng)，因此，若采用反射光柵，將使系統(tǒng)的光軸發(fā)生折轉(zhuǎn)，從而給系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計帶來困難。為簡化設(shè)計，本系統(tǒng)采用透射光柵分光。

對于透射光柵，根據(jù)光柵方程，當垂直光柵入射，即入射角為零時，若取+1級或-1級衍射光譜，則衍射角不為零，即所有衍射光線將沿系統(tǒng)主光軸發(fā)生偏轉(zhuǎn)，從而造成整個系統(tǒng)為非同軸系統(tǒng)。因此，為了使整個系統(tǒng)保持為同軸光學(xué)系統(tǒng)，采用棱鏡-光-棱鏡組合的分光方式，使分光后中心波長的衍射光線沿系統(tǒng)主光軸衍射。光譜分光系統(tǒng)的主要設(shè)計參數(shù)如下：

狹縫：寬度25um，有效長度8.8mm；準直光學(xué)鏡頭：f=40mm，f/2.8；會聚光學(xué)鏡頭：f=40mm，f/2.8，與準直光學(xué)鏡頭為對稱式結(jié)構(gòu)；光柵頻率：3151/mm；前棱鏡：頂角11.8?，上寬度2.4mm，下寬度5.8mm，中心厚度4.1mm；后棱鏡：頂角11.2?，上寬度1.0mm，下寬度5.5mm，中心厚度3.2mm。

3.?載物臺自動裝置設(shè)計

根據(jù)推帚式成像光譜儀的特點，系統(tǒng)使用狹縫作為視場光闌，對瞬時視場內(nèi)的

觀測目標進行一維采樣，因此，要獲得整個觀測目標的二維圖像，必須對另一維進行推帚。用于航空遙感的推帚式成像光譜儀是借助飛機的向前運動來完成推帚的，與之不同的是，顯微高光譜成像系統(tǒng)是利用載物臺的平動來實現(xiàn)對樣品的推帚成像，因此該實驗系統(tǒng)需要設(shè)計和研制載物臺自動裝置。為了獲得準確的光譜圖像，必須對載物臺的運動速度進行精確的控制。本系統(tǒng)利用步進電機連接滾珠絲杠，將滾珠絲杠的移動橫梁連接到載物臺，來驅(qū)動載物臺運動。因此，載物臺的運動速度是通過對步進電機的轉(zhuǎn)速控制來實現(xiàn)的。而步進電機的轉(zhuǎn)速控制是通過單片機產(chǎn)生方波脈沖信號來觸發(fā)步進電機進行步進旋轉(zhuǎn)。因此，單片機產(chǎn)生的方波脈沖信號頻率最終決定了載物臺的運動速度。

系統(tǒng)的瞬時視場與系統(tǒng)的總放大倍數(shù)和CCD光譜維像元尺寸有關(guān)。在該系統(tǒng)中，CCD光譜維像元大小為27um，當使用40倍物鏡時，系統(tǒng)的總放大倍數(shù)為40?.6=24倍。因此，系統(tǒng)在光譜維方向的空間分辨率為27/24=1.125um，而相機的幀速率為30幀/秒，所以，載物臺的運動速度為1.125?0=33.75um/s。由于絲杠的螺紋間距為1mm，即1000um，步進電機的每轉(zhuǎn)步數(shù)為10000步/轉(zhuǎn)，因此，步進電機每旋轉(zhuǎn)一步對應(yīng)載物臺的前進距離為1000/10000=0.1um，最后計算出電機的運行頻率為33.75/0.1=337.5Hz，即需要產(chǎn)生的方波脈沖的周期為2963μs。

4.?數(shù)據(jù)采集子系統(tǒng)

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)主要包括高光譜結(jié)果數(shù)據(jù)傳輸、采集、控制、存儲和實時顯示等功能，由于高光譜成像系統(tǒng)的數(shù)據(jù)傳輸速率非常高，因此傳統(tǒng)的基于ISA、EISA總線的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)已不能滿足要求。而PCI總線的最大數(shù)據(jù)傳輸速率為132

MB/s，能滿足高光譜成像系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集的要求。所以，本系統(tǒng)采用PCI總線作為數(shù)據(jù)采集的微機接口。

數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計方法，將各個主要功能模塊分離開來，模塊間采用統(tǒng)一的接口進行通信；并且在數(shù)字邏輯實現(xiàn)上，采用在系統(tǒng)可編程（In System Program）器件，通過軟件對系統(tǒng)進行配置，提高系統(tǒng)的靈活性。其具體設(shè)計方法與其他高光譜成像儀器的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)類似。

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